Nowe możliwości diagnostyki molekularnej w różnicowaniu infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych

Zakład Transfuzjologii Klinicznej WIM, który dołączył do krajowej sieci laboratoriów oznaczających SARS-CoV2 jako jeden z pierwszych, bo już 11 marca 2020 r., wdrożył metodę genetycznego oznaczania w oparciu o Real-Time PCR. Posiadając odpowiednie otoczenie diagnostyczne, odpowiednio wyposażone laboratorium II klasy bezpieczeństwa mikrobiologicznego oraz doświadczony, z dużym zasobem wiedzy personel, z powodzeniem mógł włączyć się w walkę z nowym zagrożeniem.

Zbliżający się okres jesienno-zimowy charakteryzujący się co roku zwiększoną liczbą infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych, wywołanych przez wirusy grypy, RSV, rotawirusy, koronawirusy i inne, w połączeniu z możliwym jednoczesnym wystąpieniem infekcji COVID-19 może stanowić potencjalnie groźną sytuację dla pacjenta, personelu medycznego oraz całej służby zdrowia. Zakażenia wywołane przez wirusy układu oddechowego i przez SARS-Cov2 są niezwykle trudne do odróżnienia na podstawie objawów, szczególnie w początkowej fazie ich rozwoju.

Niezwykle ważną rolę w obliczu istniejących zagrożeń ma do spełnienia molekularna diagnostyka laboratoryjna dostarczającą informacji w zakresie różnicowania patogenów układu oddechowego. Jej wartość może być jednym z podstawowych składników walki z tym zagrożeniem.

 

Dziś w ZTK WIM dysponujemy, nowoczesnymi aparatami InGenius firmy EliTech, które są dedykowane diagnostyce molekularnej.

Fot. 1 Aparat InGenius firmy EliTech

Fot. 2 Interpretacja wyniku na aparacie InGenius firmy EliTech

Te wysokiej jakości analizatory laboratoryjne łączą poszczególne etapy badania prowadząc automatycznie izolację materiału genetycznego, amplifikację i interpretację wyników, posiadają niezwykle dużą elastyczność w zakresie wykorzystywanych testów diagnostycznych.
 

W diagnostyce wirusów wywołujących zakażenia dróg oddechowych, jednoznaczną i różnicująca metodą jest wykrywanie materiału genetycznego RNA/DNA z zastosowaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (polymerase chain reaction – PCR).
Technika ta polega na wysoce swoistej amplifikacji (powieleniu), poprzez wielokrotne podgrzewanie i oziębianie mieszaniny reakcyjnej w warunkach laboratoryjnych, wybranego, charakterystycznego tylko dla tego wirusa fragmentu kwasu nukleinowego. Mieszanina reakcyjna oprócz standardowych odczynników musi zawierać dobrej jakości, wyizolowany wcześniej, materiał genetyczny pochodzący z wymazu pobranego od pacjenta. Izolację materiału genetycznego w zależności od potrzeb i wyposażenia laboratorium można przeprowadzić metodą automatyczną lub manualną. Czas oczekiwania na oczyszczone wirusowe lub bakteryjne DNA lub RNA jest uzależniony od liczby izolowanych jednocześnie próbek. Liczba ta może wahać się od 2 do 48 i zajmować od 20-90 minut. Kolejnym etapem jest umieszczenie przygotowanych mieszanin reakcyjnych w termocyklerze. W zależności od liczby cykli podgrzewania i oziębiania próbki wymaganych w danej procedurze, czas amplifikacji waha się od 2 do 3,5 godziny, a więc przy całkowitym wypełnieniu aparatu, czas oczekiwania na wynik wynosi około 5 godzin.

Amplifikacja kwasów nukleinowych umożliwia wczesne wykrycie materiału genetycznego wirusa, już w dniu wystąpienia objawów, zanim liczba antygenów osiągnie minimalny limit detekcji wymagany przez inne metody. Stosowana w ZTK odmiana PCR do wykrywania zakażenia SARS-CoV2 tzw. technika Real-Time PCR, wykorzystująca metody fluorescencyjne umożliwia obserwację narastającej ilości amplifikowanego produktu w czasie rzeczywistym.

Wychodząc naprzeciw potrzebom identyfikacji i różnicowania wielu czynników etiologicznych w jednej próbce wymazu z nosogardzieli, co najważniejsze w tym samym czasie, w ZTK WIM umożliwiono wykonanie tzw. reakcji Multiplex Real-Time RCR.
W reakcji tej zastosowanie jednocześnie wielu znakowanych fluorescencyjnie sond, umożliwia amplifikację i monitorowanie narastania produktów reakcji w odpowiednim dla danej sondy kanale pomiarowym. W celu usprawnienia oraz obniżenia kosztów badania wykorzystywany jest w jednej mieszaninie reakcyjnej zestaw starterów do identyfikacji więcej niż jednego wirusa, co pozwala na uzyskanie w jednej mieszaninie reakcyjnej produktów amplifikacji nawet kilku różnych fragmentów RNA, z których każdy jest swoisty dla innego wirusa. Niepodważalną zaletą reakcji multipleksowych jest mniejsze zużycie odczynników (tym samym niższy koszt analizy), mniejsza ilość potrzebnego, matrycowego RNA lub DNA a także oszczędność czasu, szczególnie w przypadku konieczności badania dużej liczby próbek. Inną niezwykle ważną zaletą reakcji multipleksowych jest możliwość rozpoznania koinfekcji.

 

W Zakładzie Transfuzjologii Klinicznej powstała możliwość jednoczesnego wykrywania 19 patogenów układu oddechowego:

wirusa grypy A
wirusa grypy B
wirusa grypy AH1N1
wirusa RSV A oraz RSV B
paragrypy 1, paragrypy 2, paragrypy 3, paragrypy 4
adenowirusa
metapneumowirusa
bokawirusa
rinowirusa
enterowirusa
koronawirusów: 229, NL63, OC43, HKU1 i SARS Co2

Fot. 3 Panel do diagnostyki różnicowej zakażeń wirusami układu oddechowego

Fot. 4 Panel do diagnostyki różnicowej zakażeń wirusami układu oddechowego

Fot. 5 Wnętrze aparatu InGenius firmy EliTech w czasie pracy

Stosowany panel pozwala na diagnostykę różnicową wymienionych wyżej patogenów u jednego pacjenta z jednego wymazu lub wydzieliny z nosogardzieli w tym samym czasie.

Pracownia Zakładu stosująca metody biologii molekularnej nabrała doskonałego doświadczenia oznaczając SARS-CoV2. Została wyznaczona przez PZH jako pracownia referencyjna, weryfikująca badania z innych laboratoriów. Podobnie jak w przypadku diagnostyki zakażeń SARS-CoV2 i szybkiej reakcji na wyzwanie, jakim stała się identyfikacja wirusa, u progu zwiększonej liczby infekcji górnych i dolnych dróg oddechowych mogących nakładać się na zakażenie koronawirusem w ZTK wprowadzono metody genetyczne uznane za najbardziej czułe i specyficzne, pomagające w różnicowaniu tych zakażeń.

Doświadczenia Zakładu Transfuzjologii Klinicznej z pierwszego etapu pandemii wskazały, że pomimo nowej sytuacji medycznej, nowego, nieznanego patogenu, laboratoria niestereotypowe, działające nieschematycznie, wdrażające innowacyjne metody pracy, mogą szybko, niemalże bezkosztowo i bez specjalnego przygotowania z powodzeniem implementować nowe procedury badawcze i podejmować nowe wyzwania.

Foto: WIM